연세대학교 공동기기원 - Yonsei University

<기기소개>

• Q-Exactive HF-X (Thermo)
• NANO LC (Thermo)

• Maximum Resolution : ≥240,000 (FWHM) for ≥1Hz scan rate
• Mass accuracy : ≤3 ppm external / ≤1 ppm internal
• MS/MS Sensitivity: 100 fg Reserpine @ ≥150:1
• Scan Rate : Up to 40 Hz
• Intra-Scan Dynamic Range: ≥ 5,000:1
• Multiplex-MS : up to 10 precursors/scan
• Polarity Switching: ≥ 60,000 Resolution @ ≤ 1sec with single injection
• Nano-ESI: Max. Pressure: ≥ 1,000bar / Max. Column length: 750mm

• 분석용 / 공동활용서비스
• 고분해능 액체크로마토 질량분석기
• 높은 분해능으로 질량을 구분하여 미지물질의 정보를 확인할 수 있어 단백질체학, 미지시료성분 ID 및 정량분석, 대사체학, 약리학 등 분석에 사용되는 분석기기
• Compound Discoverer, Proteome Discoverer 소프트웨어 설치되어 Library Search 가능

Protein Digestion : In-solution

1. 시료 준비: 샘플, 500mM Dithiotreitol (in 50mM Ammoniumbicarbonate), 500mM Idoacetamide(in 50mM ABC), Trypsin, 50mM ABC, 8M Urea
2. 8M Urea로 시료 Lysis 시킨 뒤, 500mM DTT를 샘플 volume 에 맞춰 25mM만큼 넣어줌 (샘플 volume의 1/20, 단백질 내 이황화결합 끊어줌) >> 60도에서 30~40분
3. 500mM IAA를 샘플 volume에 맞춰 25mM만큼 넣어줌 (샘플 volume의 1/20, Alkylation, 이황화 결합의 재생방지) >> 실온, 어둡게 하여 30분
4.  샘플 내 8M urea를 1M로 희석 할 정도의 Trypsin in 50mM ABC을 만들어 넣어줌 (Trypsin은 Bradford로 측정한 단백질의 농도에 비례해서 1/20~1/50정도로, Trypsin은 50mM ABC(pH ~8)에 녹여 사용하는데, 이때 volume을 urea 희석을 위해 샘플의 7~8배 정도로 만든다.)
5. 37도에서 16~18시간 incubation
6. C18 spin column desalting
7. 정제된 추출물을 speed vac 이용하여 모두 날리고 solvent A(0.1% Formic acid) 15~20uL로 회수

-> 0.02 ~ 30 ug 단백질 분석가능, 1ug/uL 농도 되게끔 회수

또는 전처리 키트 사용 (EasyPep Mini MS Sample Prep Kit 등)